Dag 4

Idag utfördes sista delen av laborationen och det var fortsättningen av Southern Blot med stringenstvätt och avslutande detektering.

Slutresultatet ses nedan:

Även här påvisas LL37, den kraftiga markeringen i brunnen för oklyvd 0,5ug är vår insert.

Man kan även se insert i brunnen för klyvd 0,005ug.

Inga markörer syns vilket tyder på att stringenstvätten gått bra.

Banden som syns för oklyvd beror på att även den innehåller LL37 samt att plasmiderna antagit olika form .

Jämför man metoderna PCR och Southern så är den senare en mkt omständigare metod, PCR är färre steg och går snabbt men Southern har fördelen att den kan identifiera även när proven har mkt liten koncentration.

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?

Framförallt tolkningen av resultatet från elektrofores för PCR och Southern Blot har gett mer förståelse för den teori som vi gått igenom.

Dag 2

Idag har du utfört en PCR.Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Resultatet blev bra, vi fick markörer för vårt plasmid DNA, PCR-provet och positiv kontroll. Dock kunde man se viss kontaminering, om än svag i vår negativa kontroll.

Problemet är när så många elever samsas om material så är det svårt att hålla kontaminering borta helt och hållet.Ett laboratorium ute i arbetslivet har mer struktur och uppdelning på vem som använder vad skulle jag tro.

Vad menar jag med att resultatet blev bra i övrigt?

Den positiva kontrollen har fungerat, vi har påvisat LL37 genen eftersom vi fått en PCR produkt som förutsätts av att primrarna har bundit till genen.Vi fick en kraftig markör för vårt plasmid-DNA som indikerar vår plasmid.RNA hade visat sig som en smear som vandrar långt i gelen men inget syntes på vårt prov.

Dag 1:

Dagens uppgift var bl.a. att rena plasmid som hade insert av LL37. 

Reningen innebar i första steget att plasmiderna skiljs från sin DNA kromosom med hjälp av alkalisk denaturering där pH:t först höjs m.h.a. NaOH, samtidigt som SDS bryter ner bakteriens cellvägg och kromosomen tappar sin normala struktur. Vid efterföljande neutralisering bildar kromosomen ett komplex som fälls ut till en pellet. 

I supernatanten finns plasmid DNA:t som sedan skulle renas från RNA vilket gjordes m.h.a. s.k. Silica kolonn. I den fanns chaotropiskt salt som gjorde att DNA binder bättre pga fler negativa laddningar än RNA:t, och på så sätt kan de separeras från varandra.

Kontroll av ev. proteininnehåll i provet gjordes genom att absorbansmäta plasmid DNA:t med spektrofotometer vid våglängderna 260nm och 280nm och sedan beräkna kvoten av A₂₆₀/_A280 som skulle vara runt 1,8. Dock kan det trots ett godkänt värde ev. finnas RNA kvar i provet.

Vårt resultat blev 1,72 vilket var godkänt.

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Kromosomalt DNA,RNA, protein, celldebris.

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Absorbansmätningen tyder på att provet är i princip fritt från protein, eftersom den beräknade kvoten är inom intervallet för godkänt resultat.

Frågor att fundera över :

Dag 1

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Dag 2

Idag har du utfört en PCR.Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Dag 4

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?