Dag 1:

Dagens uppgift var bl.a. att rena plasmid som hade insert av LL37. 

Reningen innebar i första steget att plasmiderna skiljs från sin DNA kromosom med hjälp av alkalisk denaturering där pH:t först höjs m.h.a. NaOH, samtidigt som SDS bryter ner bakteriens cellvägg och kromosomen tappar sin normala struktur. Vid efterföljande neutralisering bildar kromosomen ett komplex som fälls ut till en pellet. 

I supernatanten finns plasmid DNA:t som sedan skulle renas från RNA vilket gjordes m.h.a. s.k. Silica kolonn. I den fanns chaotropiskt salt som gjorde att DNA binder bättre pga fler negativa laddningar än RNA:t, och på så sätt kan de separeras från varandra.

Kontroll av ev. proteininnehåll i provet gjordes genom att absorbansmäta plasmid DNA:t med spektrofotometer vid våglängderna 260nm och 280nm och sedan beräkna kvoten av A₂₆₀/_A280 som skulle vara runt 1,8. Dock kan det trots ett godkänt värde ev. finnas RNA kvar i provet.

Vårt resultat blev 1,72 vilket var godkänt.

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Kromosomalt DNA,RNA, protein, celldebris.

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Absorbansmätningen tyder på att provet är i princip fritt från protein, eftersom den beräknade kvoten är inom intervallet för godkänt resultat.