Dag 2
Idag har du utfört en PCR.Hur blev resultatet? Om
du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan
lita på resultatet?
Resultatet blev
bra, vi fick markörer för vårt plasmid DNA, PCR-provet och positiv kontroll.
Dock kunde man se viss kontaminering, om än svag i vår negativa kontroll.
Problemet är när
så många elever samsas om material så är det svårt att hålla kontaminering borta
helt och hållet.Ett laboratorium ute i arbetslivet har mer struktur och uppdelning
på vem som använder vad skulle jag tro.
Vad menar jag med
att resultatet blev bra i övrigt?
Den positiva
kontrollen har fungerat, vi har påvisat LL37 genen eftersom vi fått en PCR
produkt som förutsätts av att primrarna har bundit till genen.Vi fick en
kraftig markör för vårt plasmid-DNA som indikerar vår plasmid.RNA hade visat
sig som en smear som vandrar långt i gelen men inget syntes på vårt prov.
Hej Henrik!
SvaraRaderaJag vet inte vad det är man ser i den negativa kontrollen, men jag skulle inte kalla det för "kontaminering". Det man är rädd för vid PCR är att man får Carryoverkontamintation av just den sekvens man vill påvisa. I så fall syns det som ett band, som vandrat lika långt som det du amplifierat i ditt plasmidprov.
Synd att markörbanden inte syns så tydligt. Varför hade vi en markör med? Använde du den för att ta reda på något om dina prover?
På dag 1 kommenterade jag att du missat att nämna en förorening som man skulle kunna se på gelen. Du nämner inget om den här heller. Kontrollera att du vet vilken förorening jag menar, och hur du skulle kunna upptäcka den på en gel. Någon annan kanske kan upplysa Henrik om vad jag menar?
Märit
Markören var för att identifiera ungefärligt antal baspar på vår PCR-produkt.
SvaraRaderaJag antar att du menar förorening av kromosomalt DNA.Det hade visat sig som markörer innan(ovanför) markören för plasmid DNA:t eftersom det är längre i antalet baspar och inte skulle vandrat lika långt i gelen som plasmiden.
Hej Henrik,
SvaraRaderaJag tror att det band som syns över det starka bandet(supercoil form) i plasmid prep. är primerna som har inte förbrukats när tillsatts och eftersom de har linjära form och storre än supperciol form så de kunnde inte vandra längs ner. om vi jämförar med markören skulle kromosomalt DNA ligga längs upp mer.
Hadel Ahmed
Hej, i plasmidpreppen (brunn 3) hade vi väl inga primers. Funderar på om det kan vara öppna eller linjära plasmider som syns svagt ovanför CCC-plasmiden?
SvaraRaderaHej Henrik!
SvaraRaderaBra svar i dina kommentarer här ovan. I plasmidpreparationen finns inga primers, och dessutom är primers mycket mindre än plasmiden. Jag tror också att det kan vara plasmider med öppen cirkel eller linjära fragment.
Du skriver markörer, när du menar att ni ser ett tydligt band, dvs molekyler färgade av GelRed. Det kan lätt missförstås, eftersom man oftast kallar storleksmarkörerna för endast "markörer".
Märit